[Protein assay] Bradford assay

Bradford assay

출처: DAWINbio

적갈색인 Commassie Brilliant Blue G-250 시약이 단백질을 만나면 파랗게 변하게 되는데 그 정도를 흡광도로 측정해서 단백질의 양을 구할 수 있다. 

반응이 매우 빠르고, 민감도가 높아 가장 흔하게 사용되는 단백질 정량법 중 하나이다.

그러나 salt, detergent, lipid 등에 의해 정량값에 영향을 받을 수 있으므로 주의해야 한다. ex) SDS, triton X-100 

 

목적

단백질 정량, 즉 샘플 內 단백질의 양을 아는것이 이 실험의 목적이다.

우리 실험실에서는 때로 특정 약물이 아닌, 단백질이 주 성분인 물질을 세포에 처리하기도 하는데

이때 각 실험마다 일정한 농도의 물질을 처리하기 위해 단백질 정량을 한다.

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원리

기본적으로 단백질은 pH 환경에 따라 다음과 같은 성질을 띤다. Bradford reagent는 산성화된 Coomassie G-250이다. 

즉, 반응 환경은 산성이다.

Coomassie Brilliant Blue (출처: wikipedia)

Commassie Brilliant Blue G-250는 anionic (blue), neutral (green), and cationic (red)의 세가지 형태를 가진다.

산성상태에서 이 염색약은 doubly-protonated red form 형태로 존재한다.

염색약과 단백질은 두가지의 비공유결합에 의해 결합한다.

1) van der Waals forces

1. Commassie Brilliant Blue G-250는 단백질의 이온화 가능한 아미노산의 잔기에 비결합전자쌍을 전달한다.
2. 단백질의 중성상태가 무너지고, hydrophobic pocket(소수성 부위)을 노출시킨다.
3. 소수성 부위의 노출은 단백질의 carboxyl group(-COOH)과 염색약의 non-polar region 사이의 반델발스 힘에 의한 결합을 가능케 한다.

2) ionic interaction(이온결합)

   4. 또한 단백질의 amine group(NH3)이 염색약의 음전하를 띠는 부위(SO3-)와 이온결합을 이루게 한다.

 

이렇게 단백질과 결합한 Commassie Brilliant Blue G-250는 음이온을 띠게 되고 파란색(최대 흡광도 595 nm)을 띠게 된다.

반면 단백질과 결합하지 않는다면 그대로 적갈색(465 nm)을 띤다.

 

우리는 595 nm 파장에서 흡강도를 측정하여 단백질과 얼마나 결합했는지 알 수 있다.

(lambert beer 법칙에 의하면 흡광도는 농도와 비례하므로 단백질의 정량이 가능!!)

 

Protocol

정확한 단백질 양을 알고 있는 물질(bovine serum albumin (BSA) 또는 bovine γ-globulin (BGG))을 standard로 해서 sample의 단백질 양을 정량해보자!

 

<Standard 준비>

우리 실험실에서는 BSA를 1.5 mg/ml 농도로 stock 해놓고 사용한다. 

25 ug/ml 농도를 최대 농도로 하여 2배씩 희석한다.

1. 25 ug/ml 농도 1ml 만들기: BSA 16.6 ul + DW 983.4 ul
2. E tube에 DW 0.5 ml씩 넣어두고 위에서 만든 최대 농도부터 0.5 ml 씩 희석해준다. (마지막은 only DW)
3. 0 - 1.6 - 3.125 - 6.25 - 12.5 - 25 (ug/ml)

<Sample 희석>

Sample을 적당히(경험 필요,,) 희석한다.

보통 한 샘플당 두가지 희석배수로 희석하여 standard curve의 중간에 가까운 값을 사용한다.

우리 실험실에서는 10배, 20배, 100배 등 예상되는 sample 속 단백질의 양에 따라 희석배수를 정한다.

(standard의 최대 농도가 25 ug/ml 이므로 이 안에 들어오게!!!)

 

<Commassie Brilliant Blue G-250 처리>

각 standard와 샘플을 두 well씩 처리하여 평균값을 이용할 것이다.

1. 96-well plate에 Commassie Brilliant Blue G-250를 40 ul 씩 분주한다. 
2. Standard와 샘플을 각 160 ul 씩 분주한다.
3. room temperature에서 5분~10분 반응시킨 후 microplate reader로 흡광도 595 nm에서 측정한다.

색깔 참고하세용~!

<standard curve를 이용하여 최종 값 구하기>

 

1. 우선 standard의 농도별 평균값을 구한다.
2. standard에서 0 ug/ml 농도 값을 0으로 만들기 위해 각 평균 값에서 0 ug/ml 값(예시에서 0.376)을 빼준다. (표에서 '-0')
3. 이 값들로 standard curve를 그리고, 추세선과 함수를 표기한다.
4. 이제 각 sample의 희석배수별 평균값을 구한다.
5. standard에서 0 ug/ml 값(예시에서 0.376)을 모두 빼줬으므로 여기에서도 같은 값을 빼준다.
6. 우리는 흡광도(y 값)를 측정했고, 이를 통해 최종적으로 단백질의 양(x 값)을 알고 싶기 때문에, 함수에 대입하여 x 값을 알아낸다. (=(sample 보정값 - 0.015)/0.017)
7. 수식에 대입해서 나온 x 값에 희석배수를 곱한다. 
8. 이들 중 standard curve의 중앙에 들어간 값이 더 정확한 값이다. (20배 희석 sample의 보정값인 0.648은 standard curve에서 벗어났으므로 정확하지 않음. 예시에서 샘플은 1100 ug/ml 농도의 단백질이라고 할 수 있음.)

 

 

 

 

한번만 해보면 정말 간단하고 시간도 얼마 안걸리는 실험이라는 것을 알게 될 거다! 

 

-끝-